En este cuadro en el que se presenta a Santa Ana recibiendo el anuncio del Ángel sobre la Concepción de María, esta basado en un pasaje de los Evangelios Apócrifos, posiblemente en el llamado Protoevangelio de Santiago, está dispuesto en el primer cuerpo del retablo, a la izquierda del eje central, y tiene como protagonista a la madre de María, culto importantísimo en el siglo XV.

La escena está plasmada con magistral maestría y la imagen de Santa Ana, que muestra un profundo dolor acompañado de llanto ante la contemplación de un nido de pájaros en un laurel que acrecienta aún mas su desdicha por se estéril, está fuertemente modelada, envuelta en un amplio manto que se quiebra en grandes pliegues. Es de observar como Berruguete reduce los personajes de la escena y baja considerablemente la línea de horizonte para aumentar la monumentalidad de las figuras. El fondo es de oro sin matices.